5001拉斯维加斯

目前阶段
，预防用mRNA疫苗经典的LNP制剂处方主要包含4种不同脂质成分: 可电离脂质化合物、辅助磷脂化合物、胆固醇和聚乙二醇(PEG)脂质化合物。

• 可电离脂质化合物主要作用是结合mRNA
  
  
  ，维持mRNA稳定并将其有效递呈至靶细胞
  ，同时在内涵体逃逸过程中发挥了重要作用; 

• 辅助磷脂和胆固醇在稳定LNP以及提高LNP与细胞膜融合过程中发挥重要作用，胆固醇通过填补脂质间的空隙增强LNP的稳定性
  ，并在细胞融合阶段帮助脂质体与体内细胞膜融合
  ，辅助脂质主要发挥纳米颗粒流动性的调节作用，同时也辅助与细胞膜融合的过程; 

• PEG脂质化合物则主要通过均匀分布在LNP表面增强LNP稳定性，且通过限制脂质融合以控制LNP的粒径，在体内发挥降低血浆清除
  、延长体内循环等功能。

制备mRNA-LNP一般划分为2个生产阶段: 首先是通过线性化的质粒模板进行转录

、加帽和纯化得到mRNA原液。成品的生产工艺流程通常是将mRNA溶解在pH酸性的水相缓冲液中
，脂质成分按照一定的比例溶解在乙醇溶液中，有机相的脂质混合溶液和水相的mRNA溶液按一定的流速比经纳米混合设备(微流控芯片设备或者射流混合器)混合得到mRNA-LNP包封液
，包封液经pH调节及稀释、超滤
、浓缩和无菌过滤后得到最终的mRNA-LNP成品。

如图1所示，在mRNA-LNP形成过程中
，首先在酸性缓冲溶液中脂质乙醇溶液和mRNA水溶液进行混合，酸性条件下可电离阳离子脂质化合物中叔胺基团迅速被质子化形成带有正电的季铵盐结构，与带有负电荷磷酸基团的mRNA通过静电相互作用形成疏水性复合物
，该复合物结构一般为反六角相的结构
，其他脂质成分由于其两亲的结构特性形成胶束、囊泡等颗粒结构，在该过程中得到的主要是一些小颗粒复合物。上述不规则的小颗粒复合物分散在含有乙醇的酸性缓冲溶液中，需要立即将LNP置于中性缓冲液中进行稀释和透析(或超滤)。

随着pH值的升高，脂质颗粒之间发生融合，各脂质组分重新分配
，可电离脂质去质子化使其电荷趋向中性，与mRNA的静电结合能力下降。在水相环境中
，可电离脂质和胆固醇发生分离，在LNP内部形成无定形的油相内核，而双亲性的辅助磷脂和PEG脂质在外层形成单层
、双层或者多层的壳状结构，最终形成一个热力学稳定的壳核球状结构
。

通过mRNA-LNP形成过程，可以看出脂质成分比例、脂质相和水相的流速及比例、缓冲盐种类及浓度
、过程中pH控制以及稀释纯化方法都会直接影响到mRNA-LNP颗粒大小、包封率
、表面电势、颗粒形态等关键质量属性。

LNP在生产及储存过程中粒径出现不均一、不稳定且变化较大的共性问题
，这也是在mRNA疫苗多年开发过程中全球聚焦的问题之一。制剂制备过程中，尽管mRNA-LNP形成的上述原理较为通用，但由于各企业制剂处方、制剂工艺及设备的不同
，LNP粒径在不同工艺阶段的动态变化也会有所差异。

产品粒径变化可能存在以下3种情形: 

①LNP包封到成品放行检测粒径均无明显变化

。

②LNP自包封至半成品粒径较为稳定
，成品放行检测中因产品贮存条件原因(涉及冻融)
，呈现粒径明显增大现象。

③在包封后的各步稀释

、pH调整步骤粒径增大明显

，之后趋于稳定，反复冻融对粒径未产生明显影响

。

mRNA疫苗创新程度较高且工艺复杂
，整体上多种因素可能影响mRNA-LNP颗粒形成以及颗粒的大小
。目前对粒径变化原因进行充分分析存在挑战
，粒径大小对药品安全有效性的影响也尚需在临床试验中进行进一步验证。但从生产工艺稳定性及批间一致性角度，粒径处于相对稳定的状态更利于质控。

从评价角度提出如下科学建议:

①在处方和工艺研究初期开展并积累更多的粒径-工艺参数相关性研究数据
，依据相关影响因素持续优化生产工艺、储存条件等; 

②对不同LNP生产阶段工艺参数设置、LNP变化趋势进行深入研究
，并建立适宜的内控，主要考虑阶段及因素如产品包封、包封后稀释、超滤
、半成品配制各步的pH控制范围，对于pH变化较大的和/或pH接近可电离阳离子pKa的步骤，研究LNP粒径及其分布是否改变及其变化趋势; 

③采用多种检测方法对粒径进行更深入的研究
，除常规的动态光散射(DLS)法，还可以采用纳米颗粒追踪分析(NTA)、电镜计数、凝胶色谱，纳米流式等方法; 

④除平均粒径外，建议积累颗粒累积分布D10
，D50
，D90以及总粒子计数等参数，以期达到LNP粒径在一定条件下可以相对稳定的目标

。

综上所述，mRNA-LNP的形成和结构转变的过程是一个由动力学控制逐渐转为热力学控制的过程。文献报道的mRNA-LNP冷冻电镜图主要包含2种结构类型
，分别为无囊泡突出的单室结构以及含有双层囊泡突出结构的双室或多室结构。

在mRNA-LNP的制备过程中，多种因素可能影响到mRNA-LNP的形态
，如脂质种类

、包封过程中的流速比、从pH酸性到中性的中和以及最终的透析超滤过程使用的缓冲盐种类及浓度等
。同时
，mRNA-LNP成品在长期储存、反复冻融以及冻干复溶的过程也会引起LNP内部脂质、水和mRNA的重新分布，从而导致mRNA-LNP形态变化。

针对mRNA-LNP的颗粒形态表征方法目前主要有透射电镜(TEM)、冷冻电镜(cryo-TEM)
、原子力显微镜(AFM)
、小角X射线散射(SAXS)
、差示扫描量热法(DSC)、DLS、NTA等方法
。其中

，虽然冷冻电镜存在仅能对局部视野进行定性监测

、受主观影响较大等缺点，但其仍是当前颗粒形态表征中较为成熟的方法，且观测结果也较能反映颗粒实际状态


。

目前，国内外已上市和正在研发的mRNA疫苗LNP多为无囊泡突出的单室结构，但也有部分研究的电镜图显示其LNP颗粒极度不均一，形态各异，存在空泡和/或融合等现象。虽然有文献报道mRNA-LNP的囊泡结构可增加体外细胞转染效力及小鼠体内蛋白表达，但上述研究仅为实验室探索性研究。因现有临床数据较为有限，尚无确证数据表明LNP囊泡结构与mRNA疫苗临床的安全性、有效性具有相关性
。