一．NK 细胞与肿瘤
NK 细胞在 20 世纪 70 年代首次被确认为一种独特的淋巴亚型细胞，能够在没有预先致敏或检测特定肿瘤抗原的情况下识别并快速杀死异常细胞，从而能够起到抗肿瘤作用。目前，基于自然杀伤（NK）细胞的免疫疗法已成为癌症免疫疗法（无论是实体瘤还是血液恶性肿瘤）中一个有前途的前沿科学研究课题。
NK 细胞是具有广谱杀伤能力的先天性淋巴细胞，包括抗癌 ，抗病毒和抗移植物抗宿主病（GVHD）功能。激活的 NK 细胞可以通过直接细胞毒性和/或产生促炎细胞因子来杀死癌细胞。除了释放穿孔素和颗粒酶以消除肿瘤细胞外 ，NK 细胞还通过膜受体 CD16 或由 Fas 配体（FasL）或 TNF 相关凋亡诱导配体（TRAIL）介导的凋亡途径发挥抗体依赖性细胞毒性（ADCC）（图 1）。
图 1. NK 及CAR-NK细胞对肿瘤的细胞毒性机制。
1. 通过 NK 膜表面的 Fc 受体 CD16 在 NK 细胞杀伤肿瘤细胞中起到重要作用 ，NK 细胞通过膜受体 CD16 或通过 FASL 和 TRAIL 介导的凋亡途径引发 ADCC。2. 诱导 NK 细胞向一种或多种 TAAs 的 BiKE 和 TRiKEs 是治疗实体瘤的可行策略;3.CARs 将 NK 细胞重新定向到具有特异性抗原的肿瘤细胞上，能够精准清除肿瘤细胞 。
二．不同来源 NK 细胞
体外获得大量高纯度 NK 细胞是实现利用 NK 细胞用于临床治疗疾病的前提，目前可以从脐血 ，NK 细胞系 ，外周血，ES 细胞系以及 IPS 细胞系在体外操作获得大量高纯度 NK 细胞，并且可以通过基因操作用于产生 CAR-NK 细胞用于临床治疗（图 2）。
图 2. NK/CAR-NK 细胞的来源和生成过程 。从各种来源（例如，PB、UCB、HSC、hESCs 和 hiPSCs）分离或建立的 NK 细胞可以使用表达 CAR 的载体（例如慢病毒或逆转录病毒）进行激活和基因修饰 ，然后在 NK 细胞特异性扩增培养基中培养细胞因子，GMP 级制备的 NK/CAR-NK 可以用于临床研究和治疗。
各种不同来源 nk 生成体系有着各自不同的特点：1. 外周血来源 NK 细胞相对较容易获得 ，经过多年研究发展，目前从外周血高效扩增可以获得大量高纯度 NK 细胞，技术体系相对成熟，但相对较低的转染效率可能会限制了它们的使用。2.hiPSC 来源 NK 解决了 ES 细胞面临的伦理问题 ，目前从 hiPSC 体外生成 NK 细胞技术体系已经建立，且易于基因编辑，但较低的扩增能力限制了该技术方法在临床上的转化应用；3. 从脐血 MNC 获得高纯度 NK 细胞的技术体系也比较完善，且UCB-NK 具有更大的增殖能力，第一个 CAR-NK 临床试验使用的就是脐血来源的 NK 细胞。虽然有争议，但脐血来源 NK 细胞普遍认为比外周血来源 NK 细胞具有较低杀伤活性 。4. NK92 等细胞系来源 NK 细胞相对容易进行培养和基因编辑 ，但存在与安全问题相关的挑战，并且它们在回输前必须进行辐照阻碍了它们在受体内存在的持久性。5. 最后，NK 细胞可以从 BM 或 UCB 的 CD34 阳性细胞诱导产生 。这些细胞通常类似于 PB-NK 细胞，并显示出可清除白血病细胞和患者肿瘤细胞的能力，但分选 CD34+细胞的操作通常推高了制备成本，且体外培养技术难度更高。
综上所述，虽然 NK 细胞有多种的来源，但从成本和安全性考虑，目前以从外周血和脐血来源的 NK 能够更适合临床应用的预期 ，本文从脐血来源 NK（UCB-NK）和外周血来源 NK（PB-NK）细胞表型，分泌因子以及细胞毒性等方面进行比较。
来自 UCB 和 PB 的 NK 细胞免疫表型的比较显示出许多相似之处。例如，主要的 NK 细胞亚群 ，CD56 high 和 CD56dim 细胞在 UCB 和 PB 中以相同的比例存在。一些研究表明 ，NK 细胞触发受体（Triggering Receptor）的表达，包括 CD94，杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR;CD158a / h 和 CD158b / j），NKp46 和 NKG2D 在 UCB 和 PB NK 细胞之间没有差异 ，但也有一些研究表明 UCB 和 PB NK 细胞的某些细胞表面 markers 也存在显着差异：来自 UCB 的 NK 细胞的较低比例细胞表达 L-选择素（CD62L），可能表明淋巴结归位能力降低。同样，许多粘附分子 ，包括 CD2，CD11a，CD18 和 CD54，存在于较低百分比的 UCB NK 细胞上 。与 PB NK 细胞相比，更多的 UCB NK 细胞表达 Toll 样受体 4（TLR4），其介导对脂多糖的先天性炎症反应，尽管没有研究比较这两种 NK 细胞来源对脂多糖的反应。一些研究人员还发现，较少的 UCB NK 细胞表达与终末 NK 细胞成熟相关的受体，包括 CD8 和 CD57（图 3） 。基于此，人们很容易推测 UCB NK 细胞可能不如 PB NK 细胞成熟 。然而，两者的成熟度必须结合其他更多因素考虑，因为 UCB 衍生的 NK 细胞也表达相同或更高水平的效应分子 ，包括穿孔素和颗粒酶 B ，它们也与 NK 成熟有关 。在 UCB 的淋巴细胞门内 ，可以根据 CD45 表达观察到两部分细胞。更具体地说 ，UCB 包含 CD45dim 和 CD45 high 淋巴细胞群 ，而只有后者在成人 PB 中发现。CD45 表达减少的意义尚不清楚，需要做更多的工作来研究这两个群体之间的差异。在 UCB 中可以找到许多 NK 祖细胞群，这些种群通常不存在于 PB 中。这些群包括 CD34−CD133−CD7−CD45+lin−细胞群 ，该群细胞用白细胞介素 IL-15 和基质细胞（stromal cell）培养后可以分化成 NK 细胞。更进一步 CD34+CD7+ 和 CD34-CD7+祖细胞（progenitor cell）在 UCB 中也更丰富 ，这些细胞也能够发育成 NK 细胞。还有一些存在于 UCB 中的祖细胞群也被描述，包括 CD34−CD56−这一群贴壁细胞显示多种不同表面 markers（CD14 、CD11b、CD13 和 CD33）的异质表达 。当这一群细胞使用 FLT-3 配体（FLT-3L）和 IL-15 培养时，这些细胞显示出 CD14 的进行性丢失，逐步表达 CD56 和其他 NK 细胞受体。而 CD56 high 和 CD56dimNK 细胞亚群在 UCB 和 PB 中以大致相同的比例存在，其他 NK 细胞群 ，如 CD56−CD16+在 UCB 中更丰富 。CD56−CD16+细胞在免疫受损宿主中以更高的频率发现，包括那些患有慢性病毒感染的宿主（人类免疫缺陷病毒和丙型肝炎。这群细胞使用 IL-2 和/或 IL-15 进行培养可以逐渐表达 CD56，表明它们可能是 NK 祖细胞。与此相一致 ，UCB 来源的 CD56-CD16+ NK 细胞具有较差的细胞毒性，但在 IL-2 或 IL-15 刺激后增强。更有趣的是 ，CD56−CD16+细胞在使用 UCB 的同种异体 HCT 后被鉴定出来 ，但在 BM 或 PB 移植后没有 。图 3. UCB-NK 细胞和 PB-NK 细胞表型的差异 。与 PB-NK 细胞相比，UCB-NK 细胞的 CD16，CD2 ，CD11a，CD18，CD62L ，KIRs ，DNAM-1，NKG2C，IL-2R，CD57 和 CD8 的表达水平较低，NKG2A 和 CXCR4 的表达水平较高。四．UCB-NK 和 PB-NK 分泌细胞因子比较先前比较 UCB 和 PB T 细胞的研究表明，有丝分裂原刺激后 UCB T 细胞的细胞因子包括 GM-CSF，TNF-α，IFN-γ 分泌减少。这归因于 UCB T 细胞中 NFAT1 表达较少。虽然没有研究解决 UCB NK 细胞中的 NFAT 水平 ，但与 PB NK 细胞相比 ，来自 UCB 的 NK 细胞也显示出较低比例的 TNF-α 产生细胞。CD56 highNK 细胞是 IFN-γ 的重要来源 ，诱导 NK 细胞中 IFN-γ 产生的一种既定方法是用 IL-12 和 IL-18 刺激 。比较 IL-12 和 IL-18 诱导的 UCB 和 PB NK 细胞的 IFN-γ 反应表明，来自 UCB 的 NK 细胞产生显着更多的 IFN-γ。同样，UCB-NK 细胞在 IL-12 和 IL-18 刺激后显示出更多的 CD69 表达 ，表明 UCB NK 细胞在因子作用下能够更好的激活。许多研究表明，与 PB MNCs 相比，静息 UCB 单核细胞（MNCs）具有较低的细胞毒性。然而 ，用 lL-2 ，IL-12 或 IL-15 刺激 UCB 和 PBMC, 诱导获得的 NK 细胞杀伤能力相当 ，最近使用纯化的 NK 群体的研究证实了这些发现。与未分离的 MNC 研究一样，在 IL-2 和 IL-15 刺激后，纯化的 UCB NK 细胞毒性可以显着增加。使用其他细胞因子的实验 ，包括 IL-12 或 IL-18 单独或与其他细胞因子组合，显示出类似的效果（增加 UCB 细胞毒性）。因此，虽然毫无疑问，静息 UCB 衍生的 NK 细胞具有较低的体外细胞毒性，但它们对细胞因子刺激迅速作出反应，导致与来自成人 PB 的类似处理的 NK 细胞具有相同的细胞毒性作用 。CD56 high 和 CD56dimNK 细胞亚群在功能上的不同已经很好的被鉴定 。CD56 high 和 CD56dimNK 细胞亚群百分比在 UCB 和 PB 中的 NK 细胞是相似的，比较这两个 NK 亚群的细胞毒性的研究揭示它们有相当大的差异 。纯化的来自 UCB 和 PB 的 CD56 highNK 细胞具有低细胞毒性，这在 UCB 和 PB 中是相似的。但对于纯化的 CD56dimNK 细胞，PB 中的 CD56dimNK 细胞相比 UCB 的 CD56dimNK 细胞显示出明显更强的杀伤作用。这也是为什么普遍认为 UBC-NK 细胞比 PB-NK 具有更低细胞毒作用的原因。虽然上述 UCB-NK 细胞尤其是 CD56dimNK 细胞杀伤较低的原因尚不清楚，但 UCB 和 PB NK 细胞之间存在一些差异可以部分解释这些差异。在测试 NK 细胞对 K562 细胞结合杀伤的实验测定中，与 PB-NK 相比，UCB-NK 细胞与靶细胞的偶联物大约少 3 倍 。偶联物的降低与 UCB NKs 的粘附分子（CD2 ，CD11a ，CD18 和 CD54）相对较低的表达有关。对 UCB NK 细胞杀伤能力较低的其他可能的机制解释包括相对较高的抑制性受体复合物的表达，包括 CD94 / NKG2A 和/或 KIR。还有一些其他表面受体也可能通过静息 UCB NK 细胞来减少杀伤。例如很大一部分 UCB NK 细胞会表达的糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（GITR） 。有关细胞表型，细胞因子产生和细胞毒性的研究数据支持 UCB NK 细胞与成人 PB NK 细胞不同的观点。总体而言，UCB-NK 和 PB-NK细胞的研究表明 ，可溶性 GITR 配体（从肿瘤细胞中脱落）显着减弱 NK 细胞毒性。尽管普遍认为 UBC-NK 细胞比 PB-NK 具有更低细胞毒作用 ，但 UCB NK 细胞在细胞因子刺激后迅速获得细胞毒性，如研究表明 UCB-NK 细胞在 IL-12 或 IL-15 刺激后迅速表达 CD54，分泌与 PB-NK 一样的穿孔素和颗粒酶 。这些发现可能为 UCB-NK 细胞用于临床治疗奠定了理论基础。综上所述 ，UCB NK 细胞与 PB NK 细胞既有相似之处，也有不同之处。有关表面表型，细胞因子产生和细胞毒性的研究数据支持 UCB NK 细胞与成人 PB NK 细胞不同的观点。虽然静息的 UCB 在杀伤中显示出较低的细胞毒性，但这可以通过细胞因子刺激迅速纠正 。总体而言，UCB 和 PB-NK 细胞之间的差异不能解释为一个简单的不成熟或者细胞毒性高低的问题。需要更多的研究才能清楚揭示这两个来源 NK 所处的环境及其功能之间的差异 ，才能为更好的临床转化这两种来源 NK 打下更好的基础。
